PRODOTTO METODO ANALITICO
Avocado e soia insaponificabili (ASU-Greasine) ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

Introduzione

Ad oggi in medicina viene sempre più considerato l’utilizzo di estratti vegetali come coadiuvanti della terapia farmacologica tradizionale. Il ricorso a fitoestratti è dettato non solo dai trascurabili effetti collaterali ma anche dalla crescente evidenza sperimentale e clinica di contribuire, in modo significativo, al risultato terapeutico specialmente in patologie di tipo infiammatorio. L’infiammazione, è ampiamente noto, che sia una reazione imprescindibile dall’alterazione della fisiologica omeostasi di tessuti e organi, e necessaria a richiamare in situ i mediatori biologici del processo di riparazione e guarigione. Se però il meccanismo innescato non rientra, si instaura uno stato infiammatorio cronico che è esso stesso fonte o concausa di malattia. Una condizione di infiammazione subclinica permanente è anche quella che accompagna il fisiologico invecchiamento dell’organismo, perciò, con l’aumentare della longevità si osserva una conseguente crescita di patologie infiammatorie croniche propriamente dette oppure correlate, come ad esempio quelle cardiovascolari, osteoarticolari, autoimmuni e neoplastiche. Di fatto la ricerca sperimentale dimostra che alla base delle malattie prevalenti in questo tempo, si trova sempre un ambiente biologico persistentemente infiammato il quale favorisce e alimenta la degenerazione dei tessuti. Pertanto, intervenire con la riduzione di tale infiammazione mediante strumenti efficaci ma con minori effetti indesiderati, specie nella necessità di un uso prolungato, può essere il completamento di una terapia più efficiente. Nella pienezza degli estratti vegetali, le miscele a base della frazione non saponificabile di avocado e soia (ASU) hanno dimostrato poter essere coadiuvanti terapeutici per diverse patologie come il dolore osteoartritico, la sintomatologia artrosica di anca e ginocchio, varie malattie autoimmuni e i disturbi legati alla menopausa. Oltre ai fattori strettamente legati a tali specifici stati patologici, il comune denominatore è una protratta e/o anomala risposta immunitaria in senso infiammatorio, la quale si esplica con l’attivazione delle popolazioni cellulari a ciò deputate e la produzione da parte loro, di mediatori biologici in grado di ampliarne il raggio d’azione e l’entità. Come citato in precedenza, i cambiamenti patologici che portano all’alterazione (degradazione, degenerazione…) tissutale sono innescati da una serie di eventi biochimici, tra cui l’eccessiva produzione di citochine pro-infiammatorie. Tra queste, il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-a) riveste un ruolo di rilievo in quanto mediatore pleiotropico, in grado cioè non solo di amplificare l’infiammazione ma anche di stimolare processi catabolici (o inibire quelli anabolici) a carico dei tessuti. Il TNF-a viene prodotto anche da svariati tipi cellulari tessuto-specifici, come ad esempio i condrociti della cartilagine articolare dove è molto studiato in relazione all’osteoartrite, tuttavia cellule immunitarie ‘ubiquitarie’ come monociti/macrofagi risultano essere il modello di studio più trasversale per indagini su infiammazione e molecole che possono modularla. 

Descrizione del test: 

Per tale ragione il seguente test di attività antinfiammatoria in vitro è stato eseguito su cellule monocitarie/macrofagiche della linea J774.A1 (ATCC), attivate in senso infiammatorio mediante la stimolazione con Lipopolisaccaride e trattate con crescenti concentrazioni di ASU-Greasine (i.e. 5, 10, 20 ug/ml). Al fine di valutare l’effetto di ASU-Greasine sulla regolazione dell’infiammazione sono stati dosati i livelli di proteina TNF-a secreta, con saggio ELISA. In via preliminare agli esperimenti sono state effettuate prove di solubilità del campione in analisi in diversi solventi. Inoltre, sono stati condotti saggi di citotossicità alle suddette concentrazioni di ASU-Greasine e alle tempistiche di 24, 48 e 72h. A nessuna delle condizioni analizzate è corrisposta una tossicità cellulare del preparato in soluzione, né del veicolo utilizzato. Si è quindi optato per la tempistica di 72h come quella in cui andare a saggiare i livelli di TNF-a. I risultati della sperimentazione sono riportati in Fig.1 in cui sono mostrati i dati relativi alla concentrazione di TNF-a (pg/ml) nelle condizioni trattate con ASU-Greasine, rispetto ai controlli. 

In Fig.3 è riassunto l’effetto del trattamento con ASU in termini di percentuale rapportata al controllo positivo (i.e. cellule solo attivate con LPS, 100% attivazione/infiammazione). 


Fig.1. Livelli di TNF-a nel sopranatante cellulare espressi in pg/ml, a 72h. Le cellule trattate con ASU-Greasine a diverse concentrazioni sono state attivate con LPS. Il controllo positivo è rappresentato da cellule solo attivate con LPS (CTRL LPS). Il controllo negativo, da cellule non attivate né trattate (CTRL NT).

Dati sperimentali:

TNF-a (pg/ml)
CTRL LPS 709,184
CTRL NT 20,843
ASU-Greasine 5ug/ml 511,415
ASU-Greasine 10ug/ml 304,632
ASU-Greasine 20ug/ml 259,375

Tab.1. Concentrazione TNF-a nelle condizioni sperimentali indicate e tabulate in Fig.1 (n=3).


Fig.2. Curva standard TNF-a ELISA. Concentration (pg/ml) vs Response (OD= 450 nm).


Fig.3. Effetto del trattamento con ASU-Greasine relativo alla secrezione di TNF-a in monociti/macrofagi. Le cellule attivate con LPS sono state incubate con ASU-Greasine (5, 10, 20 ug/ml) o no (LPS). La stima dell’effetto del trattamento è espressa come percentuale di TNF-a solubile rilevato nelle condizioni trattate con ASU-Greasine rispetto a quella non trattata con ASU-Greasine (100%, LPS, controllo attivato).

Report analitico:

L’analisi condotta ha dimostrato una sensibilità congrua al rilevamento di livelli apprezzabili e attendibili della citochina solubile TNF-a (Tab.1, Fig.2). Nel contesto sperimentale volto alla ricerca di tale marcatore di infiammazione, emerge che l’attivazione cellulare in senso pro-infiammatorio viene ridotta dal trattamento con ASU-Greasine rispettivamente del: 28% alla dose di 5 ug/ml, 57% a quella di 10 ug/ml, 63% alla dose di 20 ug/ml rispetto al controllo non trattato (LPS, 100% attivazione), rappresentato da monociti/macrofagi unicamente indotti con Lipopolisaccaride.

Bibliografia:

  1. Salehi B, Rescigno A, Dettori T, Calina D, Docea AO, Singh L, Cebeci F, Özçelik B, Bhia M, Dowlati Beirami A, Sharifi-Rad J, Sharopov F, Cho WC, Martins N. Avocado-Soybean Unsaponifiables: A Panoply of Potentialities to Be Exploited. 2020, 13, 10(1), 130-150.
  2. Wong M, Ziring D, Korin Y, Desai S, Kim S, Lin J, Gjertson D, Braun J, Reed E, Singh RR. TNFalpha blockade in human diseases: mechanisms and future directions. Clin Immunol. 2008, 126(2), 121-36.
  3. Au RY, Al-Talib TK, Au AY, Phan PV, Frondoza CG. Avocado soybean unsaponifiables (ASU) suppress TNF-?, IL-1?, COX-2, iNOS gene expression, and prostaglandin E2 and nitric oxide production in articular chondrocytes and monocyte/macrophages. Cartil. 2007, 15, 1249–1255.
  4. Al-Anati L, Essid E, Stenius U, Beuerlein K, Schuh K and Petzinger E. Differential Cell Sensitivity between OTA and LPS upon Releasing TNF-?. 2010, 2, 1279-1299.
  5. Page MJ, Kell DB, Pretorius E. The Role of Lipopolysaccharide-Induced Cell Signalling in Chronic Inflammation. Chronic Stress. 2022, 6, 1-8.